GV3101 （pJIC SA_Rep）電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞

簡要描述：GV3101 （pJIC SA_Rep）電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞
GV3101（pJIC SA_Rep）菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，pJIC SA_Rep即為GV3101（pJIC SA_Rep）菌株，可幫助pgR106，pgR107，pGreen，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制，同時賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。

更新時間：2022-01-21

廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家

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詳情介紹

品牌	其他品牌	貨號	BFNC86107
規(guī)格	10x100ul/50x100ul	供貨周期	現(xiàn)貨
主要用途	僅用于科研	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè)

GV3101 (pJIC SA_Rep)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86107-01(10×100ul)/BFNC86107-02(50×100ul)

GV3101 (pJIC SA_Rep) Elec： 50μl/支
pGs2（control vector，10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質(zhì)期)： -80℃（12個月）

基因型

C58 (rif^R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent^R) Nopaline(pJIC SA_Rep -tet^R)

產(chǎn)品說明

GV3101(pJIC SA_Rep)菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性；在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pJIC SA_Rep即為GV3101(pJIC SA_Rep)菌株，可幫助pgR106，pgR107，pGreen，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制，同時賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。

青旗生物生產(chǎn)的GV3101(pJIC SA_Rep)電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pGs2(卡那霉素抗性)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>10⁶cfu/μg。

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高，*使用前盡量做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手bo打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。

GV3101 (pJIC SA_Rep)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞

備注

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧芐青霉素（carb）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
硫酸卡那霉素（kan）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
鏈霉素（strep）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	10 mg/ml	50 μg/ml
利福平（rif）	DMSO溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	10 mg/ml	20 μg/ml
慶大霉素（gent）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	20 mg/ml	40 μg/ml

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農(nóng)桿菌菌株	羧芐青霉素(carb)	鏈霉素(strep)	利福平(rif)	慶大霉素(gent)	硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1	R	S	R	S	S
EHA101	S	S	R	S	R
EHA105	S	S	R	S	S
LBA4404	S	R	R	S	S
GV3101	S	S	R	R	S

3、LB及YEB配方：

component	LB(液體)/L	LB(固體)/L	component	YEB(液體)/L	YEB(固體)/L
Tryptone	10 g	10 g	Tryptone	5 g	5 g
Yeast extract	5 g	5 g	Yeast extract	1 g	1 g
NaCl	10 g	10 g	牛肉浸膏	5 g	5 g
NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0	蔗糖	5 g	5 g
Agar	－	15 g	MgSO4*7H2O	0.49 g	0.49 g
			NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0
			Agar	－	15 g

注意事項

1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量，本公司生產(chǎn)的GV3101(pJIC SA_Rep)感受態(tài)細胞具有四環(huán)素抗性，但在轉(zhuǎn)入目標(biāo)質(zhì)粒涂板篩選陽性克隆時，只需加入目標(biāo)質(zhì)粒抗性的抗生素，不加四環(huán)素。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可以忽略)。